Argumento
El juego comienza tras los eventos ocurridos en Brotherhood. Desmond ahora se encuentra en estado de coma y es metido dentro del Animus para que su conciencia no se destruya. Es entonces que está en una isla, donde encuentra al Sujeto 16. Este le explica a Desmond que su mente está destrozada en tres partes: la de Altair, la de Ezio y la suya, y que solo despertara de su coma si termina de ver todos las memorias de Ezio y Altair para que el Animus no tenga nada mas que mostrar, y que divida de quienes son cada recuerdo. También le hace notar que él, para el Animus, es un virus que deberá ser eliminado, y que 16 hará todo lo posible para mantenerlo activo y que nadie se percate de su presencia. Luego, 16 dice que si Desmond se apura, podra llegar al funeral de Lucy, revelando que Lucy murio al final del tercer juego. Entonces Desmond entra en Las puertas Negras del Animus, reviviendo una vez mas en las memorias de su antepasado Ezio Auditore Da Firenze, quien se encuentra camino a Masyaf en deseo de cumplir el sueño de su padre: encontrar la biblioteca de Altair, el asesino antepasado de Ezio y a su vez de Desmond que cambió la historia de los asesinos para siempre. Durante su trayecto, relata todas sus aventuras a su hermana Claudia por medio de cartas.
Ezio ha viajado a la fortaleza del antiguo asesino en Masyaf para descubrir los secretos que Altaïr había descubierto previamente, y encontrar el verdadero propósito de los asesinos. Al llegar, se encuentra que Masyaf fue tomada por los templarios. Ezio se escapa a las entrañas del castillo, donde descubre la entrada a la biblioteca de Altair, tambien se entera de que son cinco "llaves" que necesita para entrar en la biblioteca, y que los templarios tienen una debajo del palacio del sultán otomano, y el resto se encuentran escondidos en Constantinopla, que forma parte del Imperio Otomano. Viaja allí y es recibido por Yusuf Tazim, líder de la Orden de los asesinos, y se hace amigo de un joven estudiante llamado Suleiman. Ezio se hace amigo de Sofía Sartor, una joven viajera italiana y coleccionista de libros, y, finalmente, se enamora de ella. Sofía ayuda a Ezio y descubre la ubicación de las llaves restantes, manteniendo sus intenciones y la posición de un secreto con ella.
Mientras tanto, Constantinopla es un caos debido a los conflictos entre el príncipe y su hermano Ahmed Selim, que están peleando sobre quién heredará el Sultanato. Atrapado en medio del conflicto, Suleiman revela a Ezio que él es un príncipe otomano, y que sospecha que los templarios están detrás de la pelea. Ezio descubre evidencia de que Manuel Palaiólogos, con el apoyo de los templarios, está tratando de levantar un ejército para derrocar a los otomanos y restablecer el imperio bizantino. Ezio mata a Manuel y se recupera la llave final, sólo para descubrir que Ahmet es el verdadero líder de los templarios para abrir la biblioteca de Altair.
Durante estos eventos, Ezio usa las llaves en su poder para presenciar la vida de Altair después de los acontecimientos representados en el primer juego. Después de matar a Al-Mualim, Altaïr tomó posesión de la manzana del Edén, y asumió el liderazgo de los Asesinos. Uno de los asesinos, Abbas, no apoyó Altaïr, debido a los acontecimientos pasados, y por matar a Al Mualim. Cuando Altaïr y su esposa María salió de Masyaf durante 10 años para repeler la invasión de los mongoles, Abbas organizó un golpe de Estado, tomar el control de los asesinos y la ejecución de los más jóvenes de Altair Sef hijo. Altaïr buscó venganza; pero como María trató de detenerlo, la rabia de Altair fue sentido por el Fruto del Edén y mató a María. Altaïr se vio obligado a huir con su hijo mayor, Darim, y entró en un exilio autoimpuesto desde hace 20 años. Altaïr finalmente volvió a Masyaf, mató a Abbas, luego tomó su lugar legítimo como líder de los Asesinos. En el proceso, dijo a la Altaïr Abbas morir de la verdad de la muerte del padre de este último. [27] Años más tarde, un anciano Altaïr codifica los recuerdos de las cinco llaves de Masyaf que necesita Ezio, después de confiarle las llaves a Niccoló.
En Constantinopla, Ezio descubre que han matado a Yusuf y que Ahmet ha secuestrado a Sofía, exigiendo las llaves a cambio de su vida. Ezio está de acuerdo, pero inmediatamente se da la persecución a garantizar la seguridad de Sofía. Se recupera las llaves, pero antes de que pueda hacer frente a Ahmet, Selim llega con sus ejércitos y ejecuta a Ahmet, después de decir que su padre "hizo su elección". Debido a la aprobación de su hijo Suleiman, Selim le dice a Ezio que debe abandonar Constantinopla, advirtiéndole que no puede volver nunca más. Después de terminar esta memoria, el Animus comienza a borrar los datos, incluyendo el exceso de Animus isla. Dieciséis se sacrifica para evitar que Desmond se eliminen por el Animus.
Ezio y Sofía regresan a Masyaf, donde Ezio utiliza las llaves para abrir la biblioteca de Altair. Él la encuentra vacía a excepción de esqueleto de Altaïr y una sexta clave. Él descubre que la biblioteca no estaba destinado a sostener los libros, más bien era una bóveda destinada a la Manzana del Edén. A través de la llave, Ezio se entera de que Altaïr había sellado dentro de sí mismo para preservar el secreto de los templarios. Ezio sale con la manzana en la biblioteca, diciendo: "He visto lo suficiente para una vida". A continuación, comienza a hablar directamente a Desmond, sin saber exactamente quién es o dónde esta, pero sabiendo que él está mirando. Él le dice a Desmond de su intención de retirarse de los asesinos, creyendo que ha servido a su propósito. Expresa la esperanza de que Desmond será capaz de encontrar las respuestas a las preguntas que él y Altaïr había trabajado tan duro para descubrir.
De repente, Desmond se acercó a Júpiter, un miembro de la primera civilización. Él explica que la primera civilización había construido numerosas criptas para estudiar los métodos para salvar el planeta de la destrucción. Todos los datos recogidos se transmiten a un centro de bóveda, donde los datos se probó. Ninguno de los métodos fueron efectivos, sin embargo no se logró detener la llamarada solar de la destrucción de su civilización. Júpiter le dice a Desmond que él tiene el poder de salvar al planeta de una llamarada solar por segunda vez, mostrándole la ubicación de la bóveda central.
* Desmond Miles. Es el protagonista del juego y uno de los 3 personajes controlables. Despues de La Hermandad, la mente de Desmond quedó hecha cenizas y atrapada en el Animus, con apenas posibilidades de recuperarse. Pero cuando conoce al Sujeto 16, este le ofrece la unica oportunidad de salir del Animus, ayudandolo en todo lo que puede mientras esta en una isla virtual que le permite crear un nexo de sincronización con sus antepasados: Ezio y Altaïr, la única forma de recomponer su mente.
* Ezio Auditore. Es el protagonista del juego y uno de los 3 personajes controlables. Despues de Assassin's Creed La Hermandad, Ezio empezó a investigar la vida de sus antepasados, hasta que viaja a Masyaf, el lugar dónde se creó la Orden de los Asesinos y descubre una vieja biblioteca sellada creada por su antepasado Altaïr. Ezio viajará a Constantinopla, en busca de las 5 llaves de la biblioteca. Mientras las busca, se topa con una enorme conspiración para conseguir el trono otomano, que tratará de detener a toda costa.
* Altaïr ibn La-Ahad. Es el otro protagonista del juego y uno de los 3 personajes controlables. Después de entregas anteriores, la historia de Altaïr continuó, y será Ezio quién descubra la fascinante historia del legendario asesino en la época que desentrañó los misterios y los poderes del Fruto del Edén, con todo lo que ello conlleva.
* Sujeto 16. El misterioso predecesor de Desmond en el Animus, ha sido protagonista de numerosas intrigas a lo largo de toda la saga. Esta vez ayudará a Desmond a escapar del Animus y de paso desvelará varios de sus secretos al Sujeto 17(Desmond).
* Yusuf Tazim. El Mentor y Maestro Asesino de Constantinopla. Le dará una calurosa bienvenida a Ezio y le enseñará las técnicas de los Asesinos otomanos, al mismo tiempo que le explica el lamentable estado del Imperio Otomano, y la conspiración que están llevando a cabo los bizantinos para acabar con los cimientos del Imperio. Además se convertirá en su mejor amigo en Constaninopla y le ayudará en todo lo que haga falta.
* Príncipe Suleimán. Nieto del actual sultán Beyazid II, e hijo del príncipe Selim. Suleimán se ve envuelta en la guerra por la sucesión del trono otomano de su padre Selim y su tío Ahmed, además de enfrentarse él sólo por la ausencia de su abuelo, su padre y su tío a la conspiración de los bizantinos, no obstante pronto contará con el apoyo de Ezio y los demás Asesinos. Es un joven muy inteligente, estudioso y preparado para ser sultán si hiciese falta.
* Sofia Sartor. Sofía es una amable mujer veneciana que tiene una tienda de libros en Constantinopla, y se verá envuelta en medio de la búsqueda de las llaves de Masyaf de Ezio. Durante el tiempo que Ezio pasa en Constantinopla, ambos se van enamorando poco a poco.
* Principe Ahmed. Hijo favorito del sultán Beyazid II y tío de Suleimán. Es el elegido por su padre, para que le suceda en el trono del Imperio Otomano, pero su hermano Selim que es el hijo mayor, reclama el trono para él, y ambos están llevando a cabo una feroz guerra por la sucesión de sultanato.
* Manuel Palaiologos. Millonario y último descendiente de la vieja casa real bizantina, que no está dispuesto a que los otomanos sigan en el poder, y aliado con los Templarios bizantinos, creará una conspiración para intentar asesinar al sultán y a toda su familia, y coronarse sultán a sí mismo.
* William M.. Alto rango de los Asesinos, que tras la muerte de Lucy se pone al mando de la célula de Desmond, Rebecca y Shaun. Tratará por todos los medios de que Desmond se recupere del coma, y lo hace introduciendolo en las entrañas del Animus, con la esperanza de que Desmond se recomponga. Su verdadera identidad y naturaleza no son reveladas hasta el último minuto del juego.
* Rebecca Crane. Ingeniera técnica y de software del Animus y Asesina. Tras la muerte de Lucy, Rebecca se muestra decaída y trata siguiendo las indicaciones de William de hacer todo lo posible para no perder a Desmond también.
* Shaun Hastings. Historiador y Asesino que se encarga de mantener las bases de datos de estos. Tras la muerte de Lucy, Shaun se muestra furioso y desconfiado de Desmond, hasta el punto de sospechar que Desmond sea Templario y abandonar el grupo para hacerle un funeral a Lucy.
* Abbas Sofian. Un asesino, cuyo padre se suicidó delante de Altaïr, y este lo contó a Al-Mualim. Desde entonces le tiene un profundo odio a Altaïr, y tras la muerte de Al-Mualim, Abbas intenta hacerse con el control de los Asesinos, y vive una cruzada durante años contra Altaïr. Muere a manos de Altaïr en uno de los recuerdos que sufre Ezio al coger una llave de la biblioteca de Altaïr durante una secuencia del Assassins Creed Revelations.
* Maria Thorpe. La esposa de Altair. Se casa con él tras los acontecimientos vivdos en Chipre en entregas anteriores, juntos intentarán desentrañar los misterios del Fruto del Edén y luchar contra Abbas.Es asesinada por Abbas y sus secuaces, Maria intenta evitar que maten a Altaïr y por esta razon le alcanzan a ella con la hoja oculta.
* Sujeto 4. Es el asesino de El Mentor de la hermandad en el año 2000 en Abu Dhabi. Sale un par de veces en la historia del mulltijugador como templario de élite. Se llama Daniel Cross y fue entrenado en el refugio cerca de Filadelfia después de salir de Abstergo Industries.
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